۳-۳-گونه مورد مطالعه
قلمه برزی­کاکتوس ( Borzicactus aurantiacus ) از باغ گیاه شناسی ارم شیراز و گلخانه موجود در دانشکده دامپزشکی شیراز تهیه شد. نمونه سند گیاه مورد مطالعه به شماره ۲۵۰۵۵ در هرباریوم دانشگاه شیراز نگهداری می­ شود.
۳-۴- شرح کلی آزمایش
قلمه برزی­کاکتوس (Borzicactus aurantiacus) در اواسط مهر ماه ۱۳۹۲ برش داده شد و به مدت یک ماه در هوای آزاد برای خشک شدن قسمت بریده شده گذاشته شد و در تاریخ ۷/۸/۱۳۹۲ در محیط­کشت­های مخلوط شده در گلدان شماره ۸ (قطر دهانه گلدان ۸ سانت بود) کشت گردید. طرح درقالب ۹ محیط­کشت مختلف و در شرایط یکسان از دما، آب و نور اجرا شد. بعد از گذشت ۸ ماه که گیاه به رشد مناسب رسید و برای انجام آزمایشات آماده شدند و به طور جداگانه برای انجام تحقیقات جمع آوری شد. برای هر آزمایش سه تکرار به صورت کاملا تصادفی اجرا شد.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۳-۵- دمای محیط آزمایش
دمای آزمایش حداقل و حداکثر گلخانه در طول دوره رشد به ترتیب۳± ۳۲ و ۳±۳۸ درجه سانتی ­گراد در نوسان بود. این دمایی است که کاکتوس در محل طبیعی زندگی با آن روبرو می­ شود.
۳-۶- نور محیط آزمایش
کاکتوس­ها در مناطق گرم و پر نور رشد می­ کنند و به نور زیادی احتیاج دارند. زیرا در محیط­های کم نور معمولا رشد علفی دارند و منظره ظاهری آنها از حالت کاکتوس بودن خارج می­ شود. به همین علت کاکتوس­های مورد مطالعه درجایی از گلخانه گذاشته شدند که بیشترین مقدار نور خورشید به آنها می­رسید.
۳-۷- آزمایش های تاثیر بستر کشت بر رشد اندام زمینی واندام هوایی برزی کاکتوس
جدا سازی اندام های هوایی و زمینی در تشتک آب صورت گرفت و برای اندازه گیری وزن خشک اندام هوایی و زیر زمینی آماده گردید.
اندازه گیری مقدار آب نسبیRWC (Relative Water Content) :
برای اندازه گیری محتوی آب نسبی گیاه یا RWC، ابتدا وزن تازه قطعات کاکتوس در ۹ بستر کشت با ۳ تکرار اندازه گیری شد. سپس این قطعات در آب و در تاریکی مطلق به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۴ درجه سانتیگراد برای تعیین وزن اشباع قرار داده شدند. سپس با قرار دادن نمونه­ها در آون به مدت ۴۸ ساعت در دمای ۶۰ درجه سانتیگراد وزن خشک آنها اندازه گیری گردید. آن گاه از طریق فرمول زیر درصد RWC محاسبه گردید:
RWC% : (وزن تازه –وزن خشک ) / (وزن اشباع –وزن خشک )×۱۰۰
۳-۸-آزمایش های اثر بسترکشت بر مقدار کلروفیل وکاروتنوئید برزی کاکتوس
۳-۸-۱-مواد و محلول های مورد نیاز
در این آزمایش ها از اندام هوایی و استون ۸۰ درصد استفاده گردید .
۳-۸-۲-اندازه گیری کلروفیل و کاروتنوئید
برای اندازه ­گیری کلروفیل و کاروتنوئید قطعاتی از محل یکسان از اندام هوایی جدا شد و ۲۰۰ میلی گرم از بافت توزین گردید و در هاون چینی قرار داده شدند. پس از افزودن مقداری استون ۸۰ درصد، قطعات کاملاً ساییده شدند و حجم آن ها با استون ۸۰ درصد به ۲۵ میلی لیتر رسانده شد. محلول های حاصل با سرعت ۴۸۰۰ دور در دقیقه به مدت ۲۰ دقیقه سانتریفیوژ گردیدند. از محلول فوقانی برای اندازه گیری کلروفیل و کاروتنوئید استفاده گردید . بدین منظور جذب محلول توسط دستگاه اسپکتروفتومتر شیمادزو مدل UV-160A که با استون ۸۰ درصد تنظیم شده بود، در طول موج های ۶۴۵ و ۶۶۳ برای کلروفیل و در طول موج­های ۴۱۲ ، ۴۳۱، ۴۶۰ و ۴۸۰ نانومتر برای کاروتنوئید اندازه گیری گردید و از فرمول­های زیر برای محاسبه مقدار کلروفیل و کاروتنوئید برگ استفاده شد . در این فرمول ها V حجم نهایی محلول بر حسب میلی لیتر و F.W. وزن تر بافت بر حسب میلی گرم می­باشد (Arnon, 1959). برای هر تیمار سه تکرار در نظر گرفته شد.

۳-۹-آزمایشهای اثر بستر کشت بر مقدار آنتوسیانین
۳-۹-۱-مواد و محلولهای مورد نیاز
متانول و اسید هیدروکلریدریک (HCL)
۳-۹-۲-روش آزمایش
۱/۰ گرم از بافت تازه اندام هوایی در لوله آزمایش قرار داده شد. درون لوله آزمایش به نسبت ۹۹ به ۱ به ترتیب متانول و اسید هیدروکلریدریک به میزان ۱۰ میلی لیتر ریخته شد. لوله های آزمایش در جای تاریک و به مدت یک شب نگهداری شدند. سپس جذب آنها در طول موج ۵۵۰ نانومتراندازه گیری شد (Wanger, 1979 ).
۳-۱۰- آزمایش های اثر بستر کشت بر مقدار اسیدآمینه پرولین در اندام هوایی برزی کاکتوس
جهت استخراج و اندازه گیری پرولین از روش Bates استفاده گردید (Bates, 1973).
۳-۱۰-۱-مواد و محلول های مورد نیاز
درا ین آزمایش از نین هیدرین (Ninhydrin)، اسید استیک، اسید فسفریک ۶ مولار، اسید سولفوسالیسیلیک ۳% ، اسید آمینه پرولین و تولوئن استفاده گردید.
۳-۱۰-۲- تهیه محلول نین هیدرین
به ۲۵/۱ گرم نین هیدرین ۳۰ میلی لیتر اسید استیک و ۲۰ میلی لیتر اسید فسفریک ۶ مولار اضافه گردید و پس از حل شدن کامل ، محلول حاصل در یخچال نگهداری شد.
۳-۱۰-۳- روش آزمایش
ابتدا ۲۰۰ میلی گرم از بخش هوایی توزین گردید. سپس ۱۰ میلی لیتر اسید سولفوسالیسیلیک ۳ درصد به هر یک اضافه گردید. پس از ۴۸ ساعت ۲ میلی لیتر از هر یک از محلول های فوق را در یک لوله آزمایش ریخته و به هر یک ۲ میلی لیتر معرف نین هیدرین (Ninhydrin) و ۲ میلی لیتر اسید استیک اضافه گردید . محتوی لوله­های آزمایش بمدت یک ساعت در حمام آب گرم ۷۸ درجه سانتی گراد حرارت داده شدند. پس از یک ساعت لوله­ها از آب گرم خارج و در یک ظرف محتوی یخ قرار داده شدند . پس از سرد شدن، درهر لوله آزمایش ۴ میلی لیتر تولوئن ریخته، آنگاه بوسیله (vortex) بمدت ۲۰ ثانیه مواد درون لوله هم زده شدند. در نهایت در هر لوله آزمایش دو فاز تشکیل گردید که از فاز فوقانی که حاوی کمپلکس قرمز رنگ است جهت اندازه گیری پرولین استفاده شد. میزان جذب نور در طول موج ۵۲۰ نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفوتومتر شیمادزو مدل UV-160A اندازه گیری گردید. از محلول پرولین با غلظت های صفر ،‌ ۴۰‌، ۸۰، ۱۲۰، ۱۶۰،‌ ۲۰۰ و ۲۴۰ میکرو مولار جهت رسم منحنی استاندارد و از لوله آزمایش با غلظت صفر پرولین بعنوان شاهد (blank) برای تنظیم دستگاه استفاده گردید.
۳-۱۱- بررسی اثر بستر کشت بر مقدار قندهای محلول در اندام هوایی برزی کاکتوس
قندهای محلول مطابق روش نلسون( Nelson, 1944) استخراج و اندازه گیری گردیدند.
۳-۱۱-۱- مواد و محلول­های مورد نیاز
در این آزمایش ها از محلول اتانول ۷۰ درصد، آب مقطر، کلروفرم، معرف مس قلیائی (Alkaline copper reagent) و محلول آرسنومولیبدات (Arsenomolybdate) استفاده گردید.
۳-۱۱-۲- تهیه معرف مس قلیایی
۵/۱۲ گرم کربنات سدیم  و ۵/۱۲ گرم سدیم پتاسیم تارتارات و ۱۰ گرم کربنات هیدروژن سدیم (NaHCO3) و ۱۰ گرم سولفات سدیم  را در ۵۰۰ میلی لیتر آب مقطر حل کرده و سپس به ترکیب حاصل ۳ گرم سولفات مس (CuSO4) که در ۲۰ میلی لیتر آب مقطر حل شده بود اضافه گردید . در نهایت یک قطره اسید سولفوریک به کل ترکیب حاصل افزوده گردید. محلول نهایی به رنگ آبی است.
۳-۱۱-۳- تهیه محلول آرسنومولیبدات
۵/۱۲ گرم آمونیوم مولیبدات  را در ۲۲۵ میلی لیتر آب مقطر حل کرده و به محلول حاصل ۱۰ میلی لیتر اسید سولفوریک اضافه گردید. آنگاه ۵/۱ گرم آرسنات سدیم  که در ۵/۱۲ میلی لیتر آب مقطر حل شده بود به محلول فوق اضافه گردید .لازم است که محلول در تاریکی و دمای ۳۷ درجه سانتی گراد نگاهداری شود که رنگ آن بعد از ۲۴ الی ۴۸ ساعت زرد می­ شود که بعد از این مدت قابل استفاده است.
۳-۱۱-۴- روش آزمایش
۲۰۰ میلی گرم بافت گیاهانی­که کشت شده بودند را در لوله های آزمایش ریخته و ۱۰ میلی لیتر اسید سولفوسالیسیلیک ۳ درصد به آنها اضافه گردید. پس از ۴۸ ساعت به ۱/۰ میلی لیتر ازمحلول موجود در لوله های آزمایش، ۹/۰ میلی لیتر آب مقطر و یک میلی لیتر محلو ل مس قلیایی اضافه گردید و به مدت ۲۰ دقیقه در حمام آب گرم ۷۸ درجه سانتی گراد حرارت داده شدند . پس از سرد شدن یک میلی لیتر محلول آرسنومولیبدات و هفت میلی لیتر آب مقطر به هر لوله افزوده شد و توسط دستگاه همزن (vortex) بهم زده شدند.
جذب نور توسط اسپکترو فتومتر مدل UV-160A در طول موج ۵۲۰ نانومتر اندازه گیری گردید و با کمک منحنی استاندارد میزان قندهای محلول مشخص گردیدند . برای تهیه منحنی استاندارد از غلظت های صفر، ۲۰ ، ۴۰، ۴۰، ۸۰ و ۱۰۰ میکروگرم گلوکز در میلی لیتر استفاده شد.بدین صورت که یک گرم گلوکز در ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر حل گردید و سپس یک میلی لیتر از این محلول به ۹۹ میلی لیتر آب مقطر اضافه شد . تا محلول ۱۰۰ میکرو گرم گلوکز در میلی لیتر حاصل گردید. سپس به ۷ لوله آزمایش به ترتیب صفر، ۲/۰،‌ ۴/۰، ۶/۰، ۸/۰ و یک میلی لیتر از محلول فوق اضافه گردید و حجم هر یک با آب مقطر به یک میلی لیتر رسانده شد و به هر لوله آزمایش یک میلی لیتر معرف سولفات مس قلیایی اضافه گردید.سپس مراحل مختلف مانند آنچه در بالا آمده است انجام پذیرفت. از لوله آزمایش فاقد گلوکز جهت تنظیم دستگاه استفاده گردید. در این آزمایش برای هر تیمار سه تکرار در نظر گرفته شد .
۳-۱۲- آزمایش اثر بستر کشت بر میزان ترکیبات فنلی کل (Total phenolics)