دستگاه­های مورد استفاده در این تحقیق به صورت زیر می­باشد:
انکوباتور شیکردار مدل INFORS FG, Eittergasse 27 , CH-4103 Bottmingen
دستگاه انکوباتور مدل Memmert
هود لامینار مدل BEASAT-BSC126
دستگاه اسپکتوفوتومتر مدل Varian cary 50 UV- visible
آون Binder
ترازوهای معمولی و دیجیتال مدل Mehlern Toledo
بن­ماری Memmert
ورتکس
اسپین
هیتر Heidolph, (Heater stirrer)
الکتروفورز
PCR ترموسایکلر مدل Hielscher
Gel doc مدل Cyngene
PH متر
سانتریفیوژ مدل NAPCO-2028R
وسایل دیگر آزمایشگاهی که در این تحقیق مورد استفاده قرار گرفتند شامل موارد زیر می باشند:
میکروتیوپ، فالکون، سمپلر، سر سمپلر،پتری دیش، ارلن، بشر، استوانه مدرج، لوله آزمایش، شیشه­های درب آبی، قاشقک، لوپ،مگنت
استخراج کوتین
در اولین مرحله شناسایی گونه­ های تولید­کننده آنزیم کوتیناز، نیاز به تهیه سوبسترای کوتین می­باشد. با توجه به عدم در دسترس بودن کوتین در بازار لازم بود که آن را از میوه­ ها تهیه کنیم. به این منظور میوه­های سیب قرمز، سیب زرد، گوجه­ فرنگی و خیارسبز از سوپرمارکت خریداری شدند. میوه­ ها شست­و­شو داده و وزن گردیدند آنگاه پوست میوه­ ها را جدا کرده و بعد از وزن کردن پوست میوه­ ها، آنها را در بافر اگزالات (۲گرم اگزالیک اسید، ۸گرم آمونیوم اگزالات، ۵۰۰ میلی لیتر آب) به مدت ۴ ساعت جوشانده شد تا پالپ­ها کاملا جدا شوند پوست­ میوه­ ها را فیلترکرده و با آب مقطر شست­و­شو داده و وزن کرده و سپس پوست­ها را در آون ۴۰ درجه سانتیگراد خشک کرده و آسیاب می­کنیم. پودر بدست آمده را در محلول کلرفرم متانول به نسبت۲ به ۱ (۶۰ میلی­لیترکلروفرم، ۳۰ میلی­لیتر متانول) می­ریزیم و به مدت ۱۲ تا ۲۴ ساعت روی شیکر قرار می­دهیم و سپس به محلول بدست­آمده آب اضافه کرده و در دستگاه سانتریفیوژ با دور ۱۲۰۰۰ و به مدت ۱۵ دقیقه سانتریفیوژ شدند سه فاز در این حالت تشکیل می­ شود که فازهای رویی را دور ریخته سپس فاز زیری را جدا می­کنیم. فاز زیری را درون پتری ریخته و پتری را در آون ۸۰ درجه سانتیگراد خشک می­کنیم. پودر بدست آمده همان کوتین است [۵۶].
نمونه برداری
نمونه­های قارچی و باکتریایی از پوست میوه و خاک باغچه (مرطوب و از برگ­های در حال تجزیه) نمونه معمولی خاک سطح برگ یا میوه­های مشکوک به آلودگی توده­ی باکتری ، ورمی­کمپوست جمع­آوری شد.
غربالگری و جداسازی گونه­ های تولیدکننده آنزیم کوتیناز
به منظور غربالگری و جداسازی سریع نمونه­های تولید کننده آنزیم کوتیناز از محیط کشتی باید استفاده گردد که کوتین تنها منبع کربن آن برای استفاده میکروارگانیزم­ها باشد و تنها میکروارگانیزم­هایی در این محیط رشد کنند که قادر به تجزیه کوتین باشند.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

این محیط کشت حاوی ترکیبات زیر است:
۰۳/۰ گرم سدیم­کلرید، ۰۳/۰ گرم آهن­نیترات، ۰۳/۰گرم پتاسیم­کلرید، ۵/۰ گرم آمونیوم­کلرید، ۰۱/۰ گرم آهن­سولفات، ۰۶/۰ گرم پتاسیم­دی­هیدروژن فسفات، ۰۲/۰ گرم منیزیم­سولفات. این مواد را در ۱۰۰ میلی لیترآب حل کرده سپس pH محیط را به ۲/۷ رسانده و به آن ۴/۰ گرم کوتین اضافه کرده و اتوکلاو شد[۵۷].
بدین منظور در ۹ فالکون در هر کدام ۱۰ میلی لیتر از محیط کشت تهیه شده در مرحله قبل ریخته و به صورت زیر کشت می­دهیم. در یکی از محیط کشت­ها چیزی کشت ندادیم و به عنوان نمونه شاهد قرار دادیم، در محیط کشت شماره یک ۱/۰ گرم از خاک باغچه ریختیم، درمحیط کشت شماره دو ۱/۰گرم خاک کمپوست، در محیط کشت شماره سه ۱/۰ گرم خاک باغچه ( پای درخت توت)، در محیط کشت شماره چهار ۱۸/۰ گرم از ناحیه­ی آلوده پوست سیب قرمز، درمحیط کشت شماره پنج ۳۵/۰گرم از ناحیه­ی آلوده­ی پوست سیب­زرد، در محیط کشت شماره شش هم۶۴/۰گرم پوست گوجه آلوده، در محیط کشت هفت ۵۹/۰ گرم از پوست آلوده به میکروب سیب زرد و درمحیط کشت شماره هشت ۱۴/۰گرم از پوست آلوده­ی سیب زرد کشت دادیم. سپس نمونه­ها به مدت ۳ تا ۵ روز در شیکرانکوباتور با دمای ۳۰ درجه وrpm 150 قرار داده شد [۸۳].
بعد از رشد کردن اولیه نمونه­ها نیاز به غربالگری آنها در روی محیط کشت جامد می­باشد. محیط کشت جامد حاوی ترکیبات زیر است:
۰۳/۰ گرم سدیم­کلرید، ۰۳/۰ گرم آهن­نیترات، ۰۳/۰ گرم پتاسیم­کلرید، ۵/۰ گرم آمونیوم­کلرید، ۰۱/۰ گرم آهن­سولفات، ۰۶/۰ گرم پتاسیم­دی­هیدروژن­فسفات، ۰۲/۰گرم منیزیم­سولفات و ۵/۳ گرم آگار را در ۱۰۰ میلی لیترآب حل کردیم. سپس pH محیط به ۲/۷ رسانده شد، به آن ۴/۰ گرم کوتین اضافه کردیم و محیط حاصل اتوکلاو گردید و بین پلیت ها تقسیم گردید. ۲۰میکرولیتر از هر محیط کشت مایع را در زیر هود در هر پلیت تلقیح کرده و بعد به انکوباتور ۳۰ درجه منتقل گردیده شد.
به دلیل اینکه نمونه­های کشت داده شده و رشد کرده خالص نبودند، برای تخلیص نمونه­ها، کلنی­های رشد کرده به پتری­های دیگر حاوی محیط کشت انتقال دادیم. بعد از رشد مناسب سویه­ها، پلیت­های موردنظر تا زمان ساخت اسلنت در یخچال ۴ درجه نگهداری می شود. سپس هر سویه را به یک slant برای نگهداری به یک محیط کشت مایع برای سنجش فعالیت کوتیناز انتقال دادیم. بعد از رشد نمونه­ها یک تک کلنی را برداشته و در محیط کشت مایع درون فالکون تلقیح داده شد و به مدت ۳ تا ۴ روز درون انکوباتور شیکردار با دور ۱۵۰ دور در دقیقه و دمای ۳۰ درجه سانتیگراد تیمار گردید. ۴ گرم نوترینت اگار را در ۲۰۰ میلی لیتر اب حل می­کنیم اتوکلاو می­کنیم سپس بین پتری­ها تقسیم می­کنیم و سپس باکتری­ ها را انتقال می­دهیم. از این پتری­ها نمونه­ها را به اسلند انتقال می­دهیم.
تهیه slant از سویه­های جدا شده
یک کلنی خاص از سویه­های جداشده را بر روی محیط اسلنت انتقال داده و بعد از انکوباسیون اسلنت­ها به مدت ۴۸ ساعت، آنها در یخچال و دمای ۴ درجه نگهداری می­شوند. اسلنت­ها را هم به مدت ۴۸ ساعت (تا زمانی که رشد کنند) در انکوباتور قرار دادیم. ۱۵۰ میلی­لیتر آب را و ۳ گرم نوترینت اگار را در بشر با حرارت ملایم حل می­کنیم و در هر لوله ۱۵ میلی­لیتر می­ریزیم بعد پنبه می­گذاریم و اتوکلاو می­کنیم بعد به صورت کج می­گذاریم تا ببندد و بعد از بستن و سرد شدن و یک کلنی خاص از سویه­های جداشده را بر روی محیط اسلنت انتقال داده و بعد از انکوباسیون اسلنت­ها به مدت ۴۸ ساعت، آنها در یخچال و دمای ۴ درجه نگهداری می­شوند. Slant ها را هم به مدت ۴۸ ساعت (تا زمانی که رشد کنند) در انکوباتور قرار دادیم. (slant به مدت یک ماه قابل نگهداری است).
نگهداری طولانی مدت سویه­ها
به منظور نگهداری طولانی مدت سویه­ها، ابتدا محیط کشت مایع نوترینت براس یا LB تهیه نموده و سویه­ها را در آن تلقیح کرده و در شیکر انکوباتور به مدت ۲۴ ساعت به منظور رشد بهینه قرار داده می­ شود سپس ۷۶۰ میکرولیتر از محیط کشت حاوی باکتری و ۷۶۰ میکرولیتراز گلیسرول ۴۰% به میکروتیوب­های ۵/۱ میلی لیتری انتقال داده و به مدت چند دقیقه به آرامی تکان داده می­ شود و در فریزر۸۰- برای طولانی مدت نگهداری می­ شود.
تهیه گلیسرول
۲۰۰ میکرولیتر گلیسرول و ۸۰۰ میکرولیتر آب مقطر را بهم افزوده و گلیسرول ۲۰% تهیه می شود.
تهیه محیط کشتLB
۵ گرم y(مخمر)
۱۰ گرم T(تریپتون)
۵ گرم nacl
این سه ماده را به هم اضافه نموده و آب مقطر به حجم یک لیتر اضافه می­ شود و اتوکلاو می­ شود.
محیط کشت LB را بعد از اتوکلاو در هر فالکون ۵ میلی­لیتر می­ریزیم و نمونه را به آن انتقال می­دهیم. سپس به مدت ۱۲ تا ۲۴ ساعت در انکوباتور می­گذاریم. بعد فالکون­های حاوی محیط کشت LB و نمونه را با rpm 4000 و به مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ می­کنیم.
۲ میلی­لیتر از محلول رویی را بیرون می­ریزیم و ۳ میلی­لیتر باقی مانده را پیپتاژ می­کنیم. بعد درون هر ویال ۶۰۰ میکرولیتر از محلول پیپتاژ شده و ۴۰۰ میکرولیتر محلول گلیسرول ۵۰ درصد می­ریزیم و به مدت چند دقیقه به آرامی تکان داده می شود بعد در یخچال ۸۰- درجه نگهداری می­کنیم.
Assay آنزیمی
به منظور assay یا سنجش فعالیت آنزیمی از تکنیک طیف­سنجی یا روش اسپکتروفتومتری استفاده می­ شود. سیستم اسپکتروفتومتر نور ثابت با طول موج دلخواه به وجود می ­آورد. پس از عبور نور از محلول، نور باقیمانده به قسمت نورسنجی یا فوتومتر می­رود. فوتومتر از نوع فتومولتی پلایر تیوب، فوتو دیود و… نور را به سیگنال الکتریکی تبدیل می­ کند. سپس سیگنال­های دریافت شده اندازه ­گیری و پردازش می­شوند تا کمیت مورد نظر به دست آید. خروجی اسپکتروفوتومتر همیشه نموداری از شدت نور نسبت به طول موج است. داده­هایی که برای تولید نمودار گردآوری شده، در جدولی از شدت نور و طول موج ذخیره می­ شود. مقدار گراف بیان کننده مقدار عبور یا مقدار جذب است. اسپکتروفوتومترهای امروزی دیجیتالی بوده و به وسیله میکروپروسور کنترل می­شوند. از این دستگاه برای اندازه ­گیری غلظت ماده رنگی محلول­ها، به طور مثال اندازه ­گیری قند، اسید اوریک، کلسترول، آنزیم­ های مختلف و… استفاده می­ شود. این دستگاه قابلیت اندازه ­گیری نمونه­های فوق العاده کوچک را داشته لذا از آن برای تجزیه و تحلیل عناصر مولکول های RNA، استفاده می­ شود.